NAD+ i NADH: vodič kroz koenzim

NAD+ je dinukleotid: dva nukleotida, jedan sa nikotinamidom i drugi sa adeninom, povezana su preko svojih fosfatnih grupa. Redoks posao obavlja nikotinamidni prsten, koji prima i predaje hidridni jon, pa koenzim prelazi iz oksidovanog oblika NAD+ u redukovani NADH i nazad. Znak plus u nazivu označava pozitivno formalno naelektrisanje na jednom atomu azota oksidovanog oblika.

Osim što prenosi elektrone, NAD+ služi i kao supstrat: troše ga reakcije ADP-ribozilacije i deacetilaze iz porodice Sir2, a iz njega nastaje i ciklična ADP-riboza, molekul koji u ćeliji mobiliše kalcijum. U bočici je oksidovani oblik, NAD+, kao liofilizovani prah. Sastav pojedinačne serije zavisi od proizvodnje, a ne od naziva jedinjenja, pa se kod dobavljača za tu seriju traži analitički nalaz — tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) za čistoću i masena spektrometrija za identitet. Dok takav nalaz ne stoji uz seriju, navedena čistoća je deklaracija dobavljača, a ne izmerena vrednost.

Tabela specifikacija uz ovaj vodič nosi dva podatka: deklarisanu čistoću i oblik u kom materijal stiže. Deklarisana čistoća je udeo imenovanog jedinjenja u materijalu, a ne sud o kvalitetu — ostatak do sto odsto čine tragovi samog postupka proizvodnje i prečišćavanja, a ne neko drugo jedinjenje. Podatak o obliku kaže šta je fizički u bočici, pa se i pre otvaranja zna da li je unutra suv prah ili gotov rastvor. Uslovi čuvanja nisu kataloški podatak; o njima je reč niže, u odeljku o rukovanju i čuvanju.

Razlika između NAD+ i NADH sedi u jednom prstenu. U oksidovanom obliku nikotinamidni prsten je piridinski; kada primi hidridni jon, postaje dihidropiridinski. Ta promena se vidi i u svetlosti koju molekul upija: oba oblika apsorbuju oko 260 nm, ali samo redukovani NADH ima i snažnu traku na 340 nm, a redukovani oblici NADH i NADPH uz to i fluoresciraju. Oksidovani NAD+ na 340 nm ne apsorbuje.

Dva oblika se razlikuju i po hemijskoj postojanosti. Oksidovani NAD+ razgrađuje se katalizom baza, pa ga visok pH ugrožava, dok se redukovani NADH razgrađuje katalizom kiselina i brže propada na niskom pH. Dva oblika istog koenzima, dakle, stradaju na suprotnim krajevima pH skale.

Četiri oblika čine dva para. NADP+ se od NAD+ razlikuje jednom fosfatnom grupom više, na 2′ položaju riboze koja nosi adenin; tu grupu dodaje enzim NAD kinaza. Tabela poredi redoks stanje, tu fosfatnu grupu, apsorpciju na 340 nm i ulogu koju pregledna literatura pripisuje svakom obliku.

Ime nikotinamid-adenin-dinukleotid čita se kao opis građe: nikotinamid, adenin i dva nukleotida. Skraćenica bez znaka, NAD, u preglednoj literaturi označava par u celini, i NAD+ i NADH, a na isti način NADP obuhvata NADP+ i NADPH. Zapis NAD(P)H koristi se kada signal potiče od oba redukovana oblika zajedno, jer se njihova fluorescencija po spektru ne može razdvojiti.

Istorija molekula duža je od njegovog imena. Harden i Young su 1906. u radu o alkoholnoj fermentaciji u soku kvasca opisali „koferment”: činilac iz prokuvanog i proceđenog ekstrakta kvasca čiji je dodatak znatno pojačavao fermentaciju u neprokuvanom ekstraktu. Von Euler i Warburg su kasnije izolovali čiste frakcije NAD+ i NADP+, a Warburg je 1936. pokazao da se redoks reakcije odigravaju upravo na nikotinamidnom delu molekula. U literaturi sredine dvadesetog veka isti koenzim stoji pod imenima difosfopiridin-nukleotid (DPN) i koenzim I. Pod imenom DPN naslovljen je, na primer, rad Preissa i Handlera iz 1958. o putu biosinteze koji danas nosi njihovo ime.

Za pretragu su zato korisni i današnji i stariji nazivi, kao i zbirni izraz piridinski nukleotidi, pod kojim se oba para obrađuju zajedno.

Fluorescencija redukovanih oblika pretvorila je koenzim u sopstveni indikator. Od sredine dvadesetog veka unutrašnja fluorescencija NADH i NADPH koristi se za praćenje redoks stanja u živim tkivima, bez dodatog obeleživača. Pošto se spektri ta dva oblika ne razlikuju, signal se beleži kao NAD(P)H, a noviji radovi dva doprinosa razdvajaju po trajanju fluorescencije (Blacker i Duchen, 2016).

Drugi pravac tiče se ćelijskih odeljaka. NADP+ i NADPH ne prolaze kroz membrane, pa ćelija ima zasebne sisteme za njihovu sintezu u pojedinim odeljcima: kod sisara je NAD kinaza pretežno u citoplazmi, a druga NAD kinaza, NADK2, u mitohondrijama (Oka i saradnici, 2023). NADPH troše, između ostalih, glutation-reduktaza i tioredoksin-reduktaza, dva enzima koja ćeliji obezbeđuju redukcionu snagu za disulfidne veze; prvi od njih, kako mu i ime kaže, radi sa glutationom.

Treći pravac je tehnički. U biokatalizi bez ćelija, gde se enzimske reakcije izvode u reaktoru, prirodni koenzimi su skup sastojak, pa je njihova postojanost u uobičajenim puferima predmet zasebnih merenja (Wolfe i saradnici, 2024). Svi pomenuti podaci potiču iz in vitro sistema, izolovanih tkiva i životinjskih modela; vodič iz njih ne izvodi nijedno dejstvo jedinjenja.

NAD+ je postojan kao suv prah, ali ne i u vodi: u rastvoru se razgrađuje katalizom baza, naročito pri visokom pH, a brzina razgradnje zavisi i od temperature i od izbora pufera. Zato se rastvor NAD+ priprema svež, neposredno pre upotrebe, a ako je u istom eksperimentu i NADH, pH se bira kao kompromis, jer NADH strada u kiseloj sredini.

Celovit postupak rekonstitucije i režim čuvanja pre i posle rastvaranja isti su za sve liofilizovane artikle u katalogu i opisani na stranici proizvoda, u odeljku „Isporuka, rekonstitucija i čuvanje”.